• <bdo id="iqq2a"><code id="iqq2a"></code></bdo>
    <bdo id="iqq2a"></bdo>
  • <blockquote id="iqq2a"></blockquote>
    <sup id="iqq2a"><input id="iqq2a"></input></sup>
  • <small id="iqq2a"><blockquote id="iqq2a"></blockquote></small>
    • 1
    • 2
    • 3
    聯系我們
    • 地址:杭州余杭經濟技術開發區興國路519號生物醫學谷5號樓二樓
      郵編:311188
      電話:0571-89028163
      手機:13003659111/13093769111
      商務QQ:1269136227
      聯系人:吳女士

    PCR操作方法及常用問題分析
    2015-8-18
    來源:互聯網
    點擊數: 6901          作者:未知
    • 一、PCR反應體系與反應條件

      PCR反應五要素: 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

      引物

      引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。

      設計引物應遵循以下原則:

      (1)引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。

      (2)引物擴增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。

      (3)引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

      (4)避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。

      (5)引物3'端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

      (6)引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。

      (7)引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物 量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

      酶及其濃度 

      目前有兩種Taq DNA聚合酶供應,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。

      dNTP的質量與濃度 

      dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris-HCL的緩沖液將其pH調節到7.0~7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP應為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。

      模板核酸 

      模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

      *50μl PCR反應體系中模板DNA的加入量?

      人基因組DNA

      0.1~1μg

      大腸桿菌基組DNA

      10~100ng

      λDNA

      0.5~5ng

      質粒DNA

      0.1~10ng

      Mg2+濃度 

      Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。

      二、PCR反應條件的選擇 

      PCR反應條件為溫度、時間和循環次數

      溫度與時間的設置: 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40 ~60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

      (1)變性溫度與時間:變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94℃l min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性,就會導致PCR失敗。

      (2)退火(復性)溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。

      引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:

      Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

      復性溫度=Tm值-(5~10℃)

      在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合, 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間完全結合。

      (3)延伸溫度與時間:PCR反應的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。

      循環次數  

      循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30~40次之間,循環次數越多,非特異性產物的量亦隨之增多。

    關于我們聯系方式客戶留言投訴建議

    免責聲明:部分技術資料來源于網絡,若有侵權,敬請告知刪除

    版權所有 Copyright(C)2015-2020 杭州博茵生技術有限公司 浙ICP備15030673號-1

  • <bdo id="iqq2a"><code id="iqq2a"></code></bdo>
    <bdo id="iqq2a"></bdo>
  • <blockquote id="iqq2a"></blockquote>
    <sup id="iqq2a"><input id="iqq2a"></input></sup>
  • <small id="iqq2a"><blockquote id="iqq2a"></blockquote></small>
    色yeye香蕉凹凸视频在线观看_俄罗斯肥妇大屁股撒尿_国产天堂久久天堂av色综合_俄罗斯女人和动zozozo