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    T-A克隆常見問題
    2015-8-18
    來源:互聯網
    點擊數: 7370          作者:未知
    • 1、連接體系中T載體和PCR片段的含量

      一般市場上各種T載體包裝濃度約為50ng/ul。常規3kb左右的T載體在連接體系中加入總量為50ng-100ng,載體和片段摩爾比一般為1 :3。比如,一個100bp片段連接到3kb的T載體中,T載體加入量60ng,則100bp片段應該為60ng。

      2、PCR片段的質量

      連接體系中PCR片段的質量對連接成敗起著關鍵作用。

      (1)PCR片段的長度不同對連接的要求也不同,過長或是較短的PCR片段需要調整連接體系;

      (2)PCR片段的純度和特異性要較高;

      (3)回收后的PCR片段濃度要合適,特別是長度較長的片段,濃度不能過低,PCR產物做膠回收會降低片段濃度。

      3、 平板沒有菌斑或是很少

      收到T載體后,一般要-20℃保存。如果短期內不能使用完,建議將載體分裝保存。在室溫或是4℃放置過久,T載體會出現末端T丟失,載體降解等情況。

      平板沒有菌斑或是很少,除T載體損壞外,其它原因有:

      (1)連接體系中的連接酶及Buffer;

      (2)末端含A的PCR片段質量,包括純度、濃度以及特異性;

      (3)感受態細胞的質量。

      4、 連接長度較短的PCR片段時,會出現菌斑過多,或是過少的情況

      在同樣總量的情況下,DNA片段長度越短,其摩爾數就會越多,這也是許多小的PCR片段容易連接,長出更多菌斑的原因。如果DNA片段摩爾數過多,就會競爭結合有限的T載體,導致連接效率降低,反而會使菌斑降低。所以,對于連接該類片段時,其摩爾數不能過多。

      5、連接長度較長的PCR片段時,常會出現菌斑較少或不長斑等情況

      常規連接時,當PCR片段長度大于2kb時,一般菌斑就會出現下降趨勢。PCR片段長度越大,菌斑就會越少。

      可以通過以下方法調試:

      (1)延長連接時間;

      (2)提高載體和片段的質量,比如,片段要為特異性單一條帶,片段不能有降解趨勢,載體和片段的純度和濃度要高;

      (3)可以嘗試調整載體和片段摩爾比,比如調整為1 :1等。

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