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    細胞培養常見問題
    2015-8-18
    來源:互聯網
    點擊數: 8047          作者:未知
    • 1、如何選用特殊細胞系培養基? 

      培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始,各種目的無血清培養最好首選AIM V(12005)培養基(SFM)。 

      2、 L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎? 

      L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。 

      3、GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定? 

      GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。 

      GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 

      4、什么培養基中可以省去加酚紅? 

      酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。 

      酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。 

      5、如何用臺盼蘭計數活細胞? 

      用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200~2000個毫升,在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞?;罴毎懦馀_盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。 

      6、 如何消除組織培養的污染? 

      當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。 

      高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。

      下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。 

      (1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。 

      (2) 分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mgml。 

      (3)每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。 

      (4)確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。 

      (5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。 

      (6) 重復步驟4。 

      (7) 在無抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。 

      7、 培養基中丙酮酸鈉的作用是什么? 

      丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 

      目錄上說,Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別? 

      HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2gL)中比在Hanks (0.35gL) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。 

      8、 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么? 

      二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。 

      我試用SF900 II時,細胞生長良好,但是我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好。 

      如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。 

      9、 20°C下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎? 

      對于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。 

      下表列出溫度改變10℃時,PH值的變化情況: 

      例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-(2x0.310)=6.78 

      緩沖系統

      pKa20℃

      [Delta]pKa10℃

      Mes

      6.15

      -0.110

      Ada

      6.60

      -0.110

      Pipes

      6.80

      -0.085

      Aces

      6.90

      -0.200

      Bes

      7.15

      -0.160

      Mops

      7.20

      -0.013

      Tes

      7.50

      -0.200

      Hepes

      7.55

      -0.140

      Tricine

      8.15

      -0.210

      Tris

      8.30

      -0.310

      Bicine

      8.35

      -0.180

      Glycylglycine

      8.40

      -0.280

      10、 室溫下(25)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少? 

      緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同的PH值。 

      4°C

      25°C

      37°C

      8.1

      7.5

      7.2

      8.2

      7.6

      7.3

      8.3

      7.7

      7.4

      8.4

      7.8

      7.5

      8.5

      7.9

      7.6

      8.6

      8

      7.7

      8.7

      8.1

      7.8

      8.8

      8.2

      7.9

      8.9

      8.3

      8

      9

      8.4

      8.1

      9.1

      8.5

      8.2

      9.2

      8.6

      8.3

      9.3

      8.7

      8.4

      9.4

      8.8

      8.5

      11、昆蟲細胞培養的最適PH值和滲透壓是多少? 

      生長培養基的PH值對細胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系,在PH值 6.0~6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時,培養基的最適滲透壓是345-380mOsmkg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式,減少技術問題,保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。 

      12、High Five細胞有任何其它名稱嗎? 

      High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 

      PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別 

      PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質的單克隆抗體生產培養基。如果作為雜交瘤生產培養基使用,PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是雜交瘤生產培養基,也是單克隆抗體生產培養基。它包含低水平的蛋白質。 

      13、在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少? 

      High Five無血清培養基中去污劑的濃度:0.025 gL Tween-80,1.0 gL Pluronic Poly-all。 

      14、High Five細胞用多大的密度凍存? 

      3.0x10E6 cellsml。 

      15、在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎? 

      可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。 

      16、 如何從T25瓶中轉移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎? 

      我們強力推薦使用脫落細胞的方法,因為這項技術破壞性最小,生活力最高。正如手冊上所顯示,通過使用巴斯德吸液管,讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。 

      胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞:

      (1)去除培養基。 

      (2)用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS。 

      (3)加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。 

      (4)37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。 

      (5) 向細胞中加入2ml 細胞培養液,移入錐形管,用2ml培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。) 

      (6)離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。 

      (7)用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。 

      17、 在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少? 

      為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位毫升細胞懸液。 

      在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎? 

      通常情況當細胞經過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候計數時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。 

      Tech tips 

      貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基,可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口,在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘,來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。 

      如果細胞培養基偶然被凍,您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生,培養基可以正常使用,如果出現沉淀,只能丟棄這些培養基。 

      當在無血清培養基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。 

      一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 

      總之,大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。 

      在進行傳代培養時,我們強烈推薦進行臺盼蘭活性記數。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳代,不進行活性檢測,您可能接種比你認為的低的多的濃度的細胞,這常??赡軐е律L緩慢或培養物根本不生長。 

      在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定。

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