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    免疫膠體金技術影響因素分析
    2015-12-9
    來源:互聯網
    點擊數: 9391          作者:未知
    • 自20世紀70年代,Faulk等(1971)用膠體金作為特殊標記物進行研究以來,建立的各種免疫膠體金技術以其特異性強、靈敏度高、操作簡捷等特點,在醫學、農牧業、環境及食品檢測等領域被廣泛應用。免疫膠體金技術的反應過程是一個由金顆粒、抗原與抗體動態結合的反應過程,在這個過程中每個環節的好壞都直接影響試驗的成敗。而試驗過程中每個環節又受到很多因素的影響和制約,下面將影響免疫膠體金技術的因素作一分析,為成功制備膠體金檢測產品提供參考。

      1、耗材的選擇

      1.1不同型號膜的篩選硝酸纖維素膜的型號在試驗中至關重要,作為反應載體影響到整個試驗的成敗。不同的生產廠家生產硝酸纖維素膜時使用的聚合物和表面活性劑的來源、類型和數量均大不相同,對生產出的膜的性能產生較大影響—膜的孔徑和分布結構不同。膜孔徑減小,膜的實際可用表面積遞增,膜結合蛋白的量也遞增;膜孔徑越小,層析速度也越慢,金標復合物通過T線的時間就越長,反應也就越充分;因此膜孔徑越小靈敏度越高,但是同時也減慢了跑板速度,增加了非特異性結合的機會,也就是假陽性越高。用于金標免疫快速試驗的膜多為硝酸纖維素膜或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜,不同的包被蛋白對膜有特定要求,試驗者應根據蛋白質的性質選擇適合孔徑大小和分布結構的膜,找到合適的平衡點,使膠體金的標記物在膜上的流動速率為最佳。

      1.2結合墊的選擇結合墊位于層析系統的中間,一般要求結合墊的網格均一且非特異性吸附低,能很好地負載膠體金標記物和待檢測樣品,而不被吸附;玻璃纖維素膜具備以上優點,同時具有一定的硬度,為試驗中常用。

      1.3樣品墊及吸水紙的選擇樣品墊和吸水紙位于膠體金免疫層析系統的兩端,對于膠體金層析系統功能的實現起著舉足輕重的作用。試驗中應根據試紙條檢測樣品的性質選擇合適的樣品墊和吸水紙,保證樣品在樣品墊形成的通道中快速地流動而不被非特異性地吸附或者改變樣品的性質。如檢測樣品為血清,則可選擇網格較疏松的玻璃纖維素膜即可;如果檢測樣品為毒素,則可選擇質量好的吸水紙和樣品墊。吸水紙則要有很好的蓄水能力,保證樣品中所用的液體都經過膜的反應區而被樣品墊吸收和蓄積。

      2、關于膠體金的制備

      制備顆粒均勻、分散度好的膠體金在金標免疫快速試驗中非常關鍵,如果金顆粒直徑的變異范圍太大就會影響到試驗的穩定性和重復性,如果金顆粒的形狀不規則或粒徑不均一,使得膠體金標記物容易解離和沉淀而產生金標擴散不完全、反應區底色過深和假陽性現象;而且膠體金質量不好,膠體金結合物就不能快速而完整的從玻璃纖維上解離,從而影響試驗結果。

      膠體金的制備除了保證藥品的質量外,制備過程中的細節關乎膠體金制備的成敗。首先是操作環境和所用容器的清潔度。所有進入溶膠內的污物都會干擾膠體金顆粒的生成或使生成的膠體金出現聚堆現象,容器最好經酸洗和硅化處理。操作環境應保持清潔無塵粒,最好有專用工作區。其次,配制溶液均需使用雙蒸水或三蒸去離子水配制,燒制膠體金最好用去離子水。再者是不同的還原劑對膠體金質量的影響。膠體金制備基于還原法,改變還原劑的性質和濃度,可制備粒徑不同的膠體金懸液。根據試驗目的選擇膠體金的粒徑,根據選擇的粒徑確定還原劑,如制備金顆粒直徑在5~12nm的膠體金溶液用白磷或抗壞血酸還原氯金酸;如制備大于12nm直徑的金顆粒的膠體金則用檸檬酸三鈉還原氯金酸。此外不同的燒制方法、膠體金的制備量、還原劑的加入方式、加熱容器的大小及加熱的時間等也影響膠體金顆粒的大小和均一性。根據所需膠體金的粒徑和數量,結合自身試驗條件選擇合適的膠體金制備方法。

      3、標記蛋白與相關抗原、抗體的制備

      標記蛋白、T線和C線的抗原或者抗體的純度和濃度直接影響金標探針的質量。獲得純度高、濃度適中的抗原、抗體,關鍵在于制備和純化方法的選擇及條件的優化。試驗前須采用高速離心去雜質,應用飽和硫酸銨沉淀、親和層析、透析除鹽等一系列處理方法,盡可能去除單克隆抗體、二抗和相關蛋白溶液中的高濃度的雜質和多余離子,避免其干擾目的蛋白與膠體金的吸附結合,或導致膠體金粒子的凝聚;特別是硼酸鹽和磷酸鹽不利于膠體金和蛋白的結合,應盡量避免接觸。同時,充分處理各種大分子蛋白,使其盡量分散為單體和具有適當的分子質量,提高膠體金與蛋白質的結合比,便于與膠體金充分而穩定的結合。

      4、膠體金的標記

      膠體金標記的兩個關鍵環節是標記時的pH和最佳蛋白質標記量的確定。根據膠體金標記的原理,只有在pH接近和稍高于蛋白質的等電點時,膠體金蛋白質的吸附力最強;pH過高過低都不利于兩者的結合,因此標記時選擇精密的酸堿度測定儀器或者試紙條,采用不同方法重復校正,并進行梯度試驗找到最佳的標記pH.溶膠與被標蛋白質的用量比例是否合適是影響標記成功的一個重要因素。過多蛋白質標記,造成浪費的同時引起試紙的拖帶現象;過少蛋白質標記,導致膠體金標記不完全,從而降低試紙的靈敏度及假陽性現象的出現。也需要在試驗中進行梯度試驗,反復比較不同標記量的標記物在破壞試驗中的穩定性,確定最佳的標記量。

      5、膜包被條件的優化處理

      膜的包被條件,包括膜的封閉、環境的濕度、T線和C線上抗原或抗體的濃度、點膜條件、溫度、包被時間等,需要結合試驗實際情況進行反復調整。包被過程中需要特別注意以下兩點:①膜上T線和C線抗原或抗體的包被量要相對飽和;②包被后的膜一定要在適宜的溫度下徹底干燥,否則會造成拖帶、顯色不清晰,靈敏度也大受影響。

      5.1封閉對使用的膜進行處理,特別是進行封閉是一個十分有爭議的問題,理論上來說購買回的膜基本上都是已經優化處理好的,直接點膜就可使用。如果點膜前將膜浸泡在封閉液內進行封閉處理,必然擾亂了膜內正常的物質分布,由此引發了許多不必要的麻煩。但是如果在實際的試驗操作過程中,發現沒有進行封閉的膜出現非特異性條帶或者出現拖帶現象,或遇到膜不封閉就無法將蛋白質或抗體包被在膜上的問題,就應考慮封閉問題。建議在制作試紙條過程中根據各自標記物的性質及其在膜上的顯色情況來選擇封閉與否,如果標記效果比較好且在膜上顯色清晰而無拖帶及假陽性現象出現,則完全沒有必要進行膜的封閉。反之,可進行膜的封閉,查找不理想現象出現的原因。用來對膜進行封閉的物質很多,多選用大分子蛋白質如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEGMW20000)等。常用的封閉方法有流動封閉和膜上定點封閉,前者將封閉物處理在樣品墊上,后者將作用物質配成溶液噴涂在膜的特定位置上。

      5.2環境濕度環境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45%~65%.濕度過低,膜上容易聚集靜電荷,點膜容易出現散點,導致測試時出現疏水斑;濕度過高,膜上毛細作用加強,點膜容易引起T線、C線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜濕度的均一性,一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。

      5.3T線和C線上抗原或抗體的濃度T線和C線上抗原或抗體的包被濃度直接影響其與金標記物的結合比例,最終影響試紙條條帶的顯色效果。包被濃度過低,膜上的條帶顯色不清晰或出現條帶中空現象;包被濃度過高,會導致C線不顯色或者出現拖帶現象。若要獲得反應穩定、顯色清晰的試紙條,須對2條線上抗原或抗體的配合濃度及兩者與金標記物的結合比進行調整和比對,以期得到最佳的組合。

      5.4點樣位置不同的T線、C線點樣位置將帶來不同的靈敏度,點樣位置上移,金標復合物通過T線位置時速度變慢,反應時間增加,靈敏度升高;反之靈敏度降低??刹捎眠@個方法來改變靈敏度和消除假陽性。

      5.5點樣儀器目前有2種點樣方式,劃膜式和非接觸點膜式。非接觸點膜式優于劃膜式,劃膜式需用軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質較為軟脆,劃管會在其表面留下印痕。劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力,導致假陽性,同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線,影響結果的判定。點樣儀器不僅可以控制T線、C線點樣位置,也可通過點膜儀器各種參數的調整控制T線與C線寬度及噴膜速度等細節,達到最好顯色效果。需要在試驗過程反復調整各項參數做比對試驗,觀察試紙條的顯色情況來決定。

      6、緩沖液

      緩沖液構成膠體金免疫層析技術的液相載體,在不影響膠體金與蛋白質、抗原與抗體、硝酸纖維素膜與T線及C線蛋白結合的前提下,并為它們的結合反應提供最佳的酸堿環境。緩沖液并不是通用的,不同的反應體系需要不同的緩沖液來支持,這就需要試驗者結合自己的試驗嘗試不同的緩沖液,確定適合自己的緩沖液配方。常用的緩沖體系是在選用的緩沖液(磷酸鹽、硼酸鹽等)中添加相應的作用物質配制而成,所謂作用物質是解決反應體系出現的某一特定問題而添加的相應物質。比如通過在緩沖液中添加適量的表面活性劑,可起到增加親水力、增色和避免線條中空現象;也可同時添加幾種物質,通過它們之間的相互協同作用共同解決相關的問題,如少量NaCl,減少信號強度,消除假陽性;糖和聚乙二醇作為保護劑,能減緩老化速度,也可以增加親水力,但也要注意作用物質的添加宜簡不宜繁。試紙條制備過程中的很多處理液都是在選擇的緩沖液的基礎上添加相應的作用物質配置而成的(如封閉液、結合墊處理液等)。

      7、樣品的處理與結果的判定

      7.1樣品的處理方法和加樣量臨床送檢標本(如全血、血清、血漿),不同的單位和檢測人員采用的處理方法不統一,也會對結果判定造成影響。如血漿內大量的纖維蛋白原,影響到層析的速度及均一性,直接影響到抗原抗體結合,處理不當甚至出現一種非特異性結合。檢測時樣品的添加量要相對充足,使膜上的反應充分進行,以便得到清晰的結果。加樣量過低,會導致樣品在試紙條上層析不充分而出現假陰性。

      7.2結果的判定由于使用膠體金產品的工作人員分布在不同的層次、不同的部門,判定結果時有很大的隨意性,判定時間不統一,特別是在工作環境、溫度、濕度的影響下,根據標志線的顯色時間隨意判定結果,而忽略了廠家制定的有效時間。因此在檢測時要求工作人員能及時分辨出試驗結果出現的假陽性、假陰性現象及異常條帶,能在查找原因后復檢或結合相關的檢測方法重新檢測進行比對和確認,避免漏檢和錯檢。

      8、產品的保存和驗證

      8.1產品的儲存剛生產出的試紙條或檢測卡一般含有5%~10%的水分,儲存過程中環境過干過濕都不利于產品的儲存。環境過干膜上的水分蒸發,會使膜變得疏水、帶電荷并變脆;環境過濕影響金標記物的質量及T線、C線的顯色效果;因此成品的試紙條和檢測卡應進行防潮設計,存放時間過長時一般要求避光、密封保存。環境的溫度也影響標記物、抗原、抗體的生物活性,在低溫條件下可有效延長產品的儲存時間。

      8.2成品驗證試驗驗證試驗包括特異性試驗、線性靈敏度試驗、穩定性試驗、樣品檢測、干擾試驗、批間批內重復性試驗等10個試驗,綜合評定產品的質量。成品驗證試驗需要的時間比較長,特別是產品的穩定性試驗需要在很長的時間內定期抽樣檢測。應結合自己的試驗,參照相應的國家或行業標準,制定針對性的試驗檢測成品的特異性、穩定性、重復性及靈敏度等指標,為進一步的優化和最終制成優質的檢測試紙條或檢測卡提供數據支持。

      綜上所述,膠體金免疫層析技術的各個環節受到種種因素的影響,也使得以免疫膠體金技術建立的檢測方法在實際應用過程中也存在著一些問題,如膠體溶液的穩定性較差、存放時間相對較短及靈敏度受到多種因素的影響而下降等,導致免疫膠體金技術的應用受到一定限制。隨著科技的進步,這些問題將在今后的研究中被逐步改善,免疫膠體金技術也將更進一步顯示其巨大的優越性,實現半定量或定量檢測及多元化檢測,拓寬其在光鏡、電鏡、流式細胞儀、免疫印跡技術、生物芯片等領域內中的應用。

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