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    PCR?片段的克隆方案集錦
    2015-8-18
    來源:互聯網
    點擊數: 7753          作者:未知
    • PCR 擴增后的產物往往要克隆到載體中,傳統的克隆方法主要有限制性酶切與連接法和 TA 克隆法。由于在 PCR 片段的兩端酶沒有足夠的空間和其結合,因此 PCR 片段的酶切比質粒酶切要困難的多。為了把 PCR 片段克隆到其他的另外的載體中,第一步是把 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 這樣的 PCR 克隆載體中。但是 TA 克隆的缺點也很明顯,諸如需要單獨購買 T 載體,連接效率不高,需要進行亞克隆等。

      如何把 PCR 片段直接克隆到一個克隆載體中?

      有時需要把 PCR 片段直接克隆到一個克隆載體中。PCR 片段和載體使用同樣的酶進

      行酶切。把經過酶切的 PCR 片段和經過酶切的載體連接起來。

      要使這種酶切和連接的成功率更高,以下幾點非常重要:

      – 設計引物時需要加保護堿基。

      – PCR 片段酶切需要的時間可能比質粒酶切時間長。

      – 如果直接克隆很困難,可以先 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 這樣的 PCR克隆載體中,然后再克隆到另外的載體。

      – 為了節省時間,明智的選擇是克隆到 T vector 或 pUC18 這樣的 PCR 克隆載體和克隆到另外的載體同時進行。

      – 片段與載體的量要足夠.

      如何更換載體?

      在做克隆之前,作酶切位點的分析很重要:

      – 用于克隆的酶在目的載體和基因片段都必須是唯一的。

      – 請檢查要使用的酶切位點在目的載體的位置。如果兩個酶切位點挨的很近,先進行一個酶切,再進行另一個酶切很必要。也就是說,先用第一個酶切質粒,進行完膠回收后再進行第二個酶切。

      – 酶切要使用足夠量的質粒:有足夠的質粒用于酶切和膠回收很重要。一個克隆培養 15mL 培養基,小量抽提質??梢垣@得足夠質粒。

      – 如果使用的酶對于目的質粒沒有切開,可以用這個酶切一下 pUC18 以便檢查這個酶是否好用。如果這個酶能酶切 pUC18 而不能酶切你的目的質粒,解決辦法是重新制備你的目的質粒。如果這個酶不能酶切 puc18,解決辦法是從另外的公司重新定購這個酶。

      如何觀察陽性克???

      在作克隆時,同時作一個陰性對照很重要。例如作連接時,載體自連作一個,插入片段自連作一個。

      理想的情況應該是這樣的:

      – 如果在陰性對照的平板上長 10-20 個克隆。而在你連入片段的平板上長超過40 個克隆。在這種情況下,挑選一些克隆作檢測,就可以挑選出陽性克隆了。

      – 如果在陰性對照的平板上沒有長克隆,就有些麻煩了,有可能酶切時間過長,導致酶切和連接失敗。

      酶切克?。?/strong>

      盡量使用相同公司的酶,先低鹽后高鹽,Buffer 控制在活力 50%以上,盡量考慮通用Buffer。

      所有的限制性內切酶切割 DNA 均產生含 5′磷酸基和 3′羥基基團的末端。有些酶能使其識別序列相對兩鏈之間的數個堿基對(base pairs)分開,形成 5′末端突出的粘性末端。還有一些酶產生具有 3′末端突出的粘性末端。如圖所示

      EcoRI5′-G▼AATT C-3′      MunI5’-C▼AATTG-3’

      3′-C TTAA▲G-5′        3’-GTTAA▼C-5’

      而另有一些酶切割 DNA 后產生平頭或鈍性末端(blunt end),如HpaI: 5′- GTT▼AAC -3′     SmaI: 5′- CCC▲GGG -3′EcoRV: 5′- GAT▲ATC -3′

      3′- CAA▲TTG -5′3’     - GGG▲CCC-5’       3’- CTA▲TAG-5’

      有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同,但切割 DNA 后產生相同類型的粘性末端,稱配伍末端(compatible end),可進行相互連接;產生平端的酶切割 DNA 后,也可彼此連接。

      TA 克隆

      原理:應用了 taq DNA polymerase 的擴增特性,在擴增后的片段尾部自動加一個 A,根據堿基配對原則,人為設計出末端含有 T 的載體,AT 配對,在 T4 DNA ligase 的作用下,把片段和載體連接在一起。PCR 片段克隆到 T vector 克隆載體:T vector 在載體的兩端各有一個突出的 T。如果擴增 PCR 片段使用的是 Taq 酶,那么擴增出的 PCR 片段在其兩端都有一個突出的 A。這樣 T vector 和 PCR 片段的 TA 堿基配對就很容易克隆。

      每個人掌握 PCR 片段克隆到 T vector 克隆載體這個技術是很重要的。但是請記住如果擴增 PCR 片段使用的是 pfu 等具有外切酶活性的酶,克隆到 T vector 不適用。

      平末端克隆

      首先將載體線性化,然后 CIAP 去磷酸化處理。 連入片段??寺》较蚝洼d體自連問題比較突出。

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