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    細胞污染與預防
    2015-8-18
    來源:互聯網
    點擊數: 7125          作者:未知
    • 細胞污染嚴重性

      污染是細胞培養技術中面臨的主要問題。由每一種細胞有其獨特的培養體系,因此污染造成后果也不盡相同。某些污染的發生(特別是支原體和少部分的真菌)往往難以察覺檢測,而且污染源能長期共存于培養體系中,在實驗前期容易被忽視。培養的細胞作為個生物體,會對培養環境以及環境中的污染物作相應的反應,造成培養細胞生物學特性的改變,而實驗結果造成潛在的威脅,而且隨著污染時間的長而增加。培養環境中的物理、化學及生物因素都可能入培養環境造成污染。由于入侵的微生物在培養系中不斷增殖、代謝,因此生物性的污染對細胞的害最大。隨著污染微生物的不斷增殖,交叉污染可能性也不斷增加。此外,微生物代謝消耗大量需的養分,同時產生多種有毒的代謝產物,如酶、抗原及毒素等,進一步對細胞產生毒害作用。因此,認識細胞培養污染的途徑及其危害性,建立細胞培規范的操作方法及規章制度,可以有效地防止污染保證實驗體系的穩定性和可靠性。

      細胞污染的類型

      一、細菌污染

      細菌污染是實驗室細胞培養中常見的污染,即使在細胞培養液中加入了抗菌素(一般為預防劑量),也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌,如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌,其中又以白色葡萄球菌較常見。

      培養細胞受細菌污染后,會出現培養液變混濁,pH改變而呈現黃色。也有的培養液肉眼觀察無多少改變,只能在鏡下發現菌體才知污染。所以,每天應仔細觀察。污染后細胞發生病理改變,胞內顆粒增多、增粗,最后變圓脫落死亡,造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。一般細菌污染進程很快,大約污染一兩天后肉眼就能顯著觀察到。

      二、真菌污染

      真菌污染是細胞培養過程中最常見的一種,尤其在霉雨季節進行細胞培養更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

      培養細胞受真菌污染后,可見培養液中漂浮著白色或淺黃色的小點,有的散在生長,培養液一般不發生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中,有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間(發生卵圓形物體污染的幾率很大)。個體細小,有增多趨勢。鏡下看時,要將培養瓶用酒精棉球擦干凈,以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后,細胞生長變慢,但最后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

      三、支原體污染

      支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物,最小直徑0.2μm,一般過濾除菌無法去除它,光鏡下難以看清它的形態結構。開始不易發現,能在偏堿條件(pH7.6~8.0)下生存,對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結構,無細胞壁,中央有電子密度大的密集顆?;蚪z狀的中心囊。

      培養細胞受支原體污染后,部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢,部分細胞變圓,從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無明顯變化,或略有變化,若不及時處理,還會產生交叉污染。

      四、病毒污染

      采用組織細胞培養法生產疫苗,如果沒有除去潛在病毒的組織培養物,會產生病毒污染。目前,從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養,但生產疫苗是不安全的。若二倍體細胞系有SV40或多發瘤病毒,B淋巴細胞含EB病毒,細胞和會發生變異、轉化,形成異倍體的細胞系。因此,潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

      五、非同種細胞污染

      由于細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開,操作不當,往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發現猴和鼠類細胞的混合物,ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的,而現在卻認為是HeLa細胞。目前,世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染,致使許多實驗宣告無效。

      非細胞培養物所造成的化學成分的污染也偶有發生,大多是由于細胞培養所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質所致。

      污染來源及鑒別

      一、污染來源

      細胞培養過程中污染的來源主要有以下幾條途徑:

      1、不潔的動物組織標本

      很多動物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統除外),但由于取材時不小心也會有污染的機會。組織本身含有細菌,如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡,也會帶菌,造成細胞污染。

      2、空氣

      空氣中含有大量的微生物,如果操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分下,很容易造成污染。另外,凈化工作臺使用過久,濾板未定期更換或長久不更換,濾氣受塵埃堵塞,工作時不帶口罩或外界氣流過強,污染空氣進入操作區,也會導致污染。春夏季南方地區多雨,空氣濕度大,含菌量多,工作不注意也易造成污染。

      3、清洗消毒

      培養用物品、材料洗刷不凈,培養用液和器材滅菌不徹底也會引入微生物和有毒物質。

      4、操作

      來自操作者的污染主要有以下幾方面:

      器材和溶液使用前未仔細檢查是否污染過,或者是否已經消毒滅菌處理過,或者雖經處理,時隔已久又末重新處理。

      操作者未戴口罩、帽子,呼出氣中排出細菌和支原體。

      培養瓶口未用75%酒精擦和燒灼。

      操作者不當心,動作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品,如手上皮膚和瓶子外壁等。

      細胞傾液時倒出培養瓶或者滴落在超凈臺上,未及時擦凈或者灼燒。

      灼燒的火不夠旺。

      移液管吸取液體時將空氣中的氣流吸入培養瓶中。

      長時間的將離心管放在離心機中,可能由于口沒有完全封閉而造成污染。

      同一根吸管或者放置吸管的離心管長時間使用造成的一管污染多瓶細胞交叉污染。

      操作者操作時大聲說話,來回走動揚起灰塵等。

      5、血清

      市售血清滅菌不徹底,潛在病毒和支原體污染。

      二、污染的鑒別

      1、細菌、真菌污染的檢測

      (1)肉眼觀察  細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生,而且增生迅速,若有污染,在48小時內可明顯觀察到。如培養液變混濁,或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

      (2)鏡下觀察  在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮,即為細菌污染。若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。

      (3)接種觀察  采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種,也可發現是否有污染。

       2、支原體污染的檢測

      (1)相差顯微鏡觀察  將細胞接種于事先放置于培養瓶內的支持物(一般用長形蓋玻片),24小時后用清潔塵鑷子從培養瓶中取出支持物,細胞面向上放置于載物片上,再蓋上較大蓋玻片,用相差油鏡觀察;若不用支持物培養法,直接取少許培養液滴在載物片上,再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒,多位于細胞與細胞之間,有時可見類似于布朗運動的表現。應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。

      (2)熒光染色法觀察  用熒光染料Hoechst33258,此染料能與DNA特異地結合,可使支原體內的DNA著色,然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為:用支持物蓋片培養法將細胞接種在蓋片上,在細胞匯合前(即未長滿前)取出玻片,于碟皿中,用不含酚紅的Hanks液漂洗,1:3醋酸鉀固定10分鐘,再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘,置于蒸餾水漂洗1~2分鐘,向細胞面滴加數滴pH5.5磷酸緩沖液,然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細胞培養液,先離心去除上清液,再加入Hanks液漂洗,離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘,再用生理鹽水漂洗后去上清液,再用Hoechst33258,DAPI或者PI等核染色試劑,染色10分鐘,加入蒸餾水漂洗,離心去上清蒸餾水,加3~5滴pH5.5磷酸緩沖液,稍吹打使沉淀細胞重懸浮,用吸管吸出,滴于載物片上,蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點,散在于細胞周圍或附于細胞表面。

      (3)電鏡檢測 可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48~72小時,細胞接近匯合前,用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行。需經過固定、包埋、切片后才能進行觀察。詳細方法同細胞形態觀察法。

      (4)培養檢測  將2.5×109/L細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基(Sigma或北京生物制品所生產的均可),培養14天后觀察肉湯培養有無霧狀沉淀,然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中,再用瓊脂培養基做分離培養,37℃培養3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。

      * 培養加熒光核染色是檢測支原體污染的黃金搭檔。

      污染的預防

      預防是防止細胞培養過程中發生污染的最好辦法。只有預防工作做在前,才能將發生污染的可能性降到最小程度。在超凈臺中進行細胞培養時,特別注意在進行移液,傾倒液體的操作過程會產生飛沫并沉積在超凈工作臺內物體的表面。超凈工作臺的氣流并不能阻止飛沫的產生,飛沫會隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺不合理的放置、不恰當的維護以及不規范的使用會破壞超凈工作臺氣流的方向導致飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導致超凈工作臺內物品污染的主要因素造成潛在污染的進一步傳播。因此為減少交叉污染的發生,應盡可能減少超凈工作臺內的物品。不同細胞系以及同一個實驗室不同操作者所使用的培養試劑一定要分開使用,如胰酶、培養液等。否則,一個操作者的失誤可能引起所有細胞發生污染。

      一般預防可從以下幾方面著手:

      一、無菌操作基本技術

      1、 實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow)以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。

      2、無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流之流通。實驗用品以5% 新潔爾滅擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。

      3、小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

       4、工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中,應避免引起aerosol 之產生,小心毒性藥品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳針頭之傷害等。

      5、定期檢測下列項目:

      5.1、 CO2 鋼瓶之CO2 壓力

      5.2、CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000 小時/HEPA)。

      6、水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。

      要特別注意的幾點:

      1、從物品、用品消毒滅菌著手

      細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底,各種溶液滅菌除菌要仔細,并在無菌試驗陰性后才能使用,并且需要盡快使用,特別注意容易染菌的液體如培養基,瓊脂糖,血清等需要在低溫保存,減少染菌的幾率。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。。

      2、從操作者做起

      (1)操作者責任心要強,要細心穩重,操作技術要熟練。在制定好實驗步驟后,頭腦清醒的進無菌室進行實驗。 備好一切所需要的試劑和培養瓶,防止在操作過程中來回跑動尋找,增加染菌的幾率。在實驗前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規定穿隔離衣。進入后關好門,坐下來盡量少走動。工作開始要先用5%新潔爾滅擦手、擦帶進的培養基瓶壁,和無菌操作臺。嚴格遵守無菌操作規則。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養物,不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內,更不能隨便使用,以免造成大批污染。盡量減少在超凈臺中物品的放置,特別注意不能將物品放置在流通空氣的慮孔上,以免降低整個超凈臺的工作效率。

      (2)操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口,并將瓶口轉動燒灼,注意火苗要旺盛,如果酒精燈中的酒精用盡要及時補充。要盡量使用侵斜試劑瓶45°的管架,減少垂直放置培養瓶造成染菌的機會。操作時盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

      (3)操作時要常更換吸管,切勿一根吸管做到底。一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾,保持實驗室清潔整齊,最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

      (4)操作過程中頭腦清醒,動作敏捷果斷,打開的培養瓶和瓶口應遠離操作者手勢范圍,避免影響垂直的空氣流將操作者身上的病菌帶到培養細胞中。廢液鋼盡量避免使用敞口的容器,傾倒時要抬高一點,防止在傾倒廢液時濺起的液體污染瓶口。

      (5)防止細胞交叉污染

      在進行多種細胞培養操作時,所用器具要嚴格區分,最好做上標記便于辨別。并按順序進行操作,避免一起進行時易發生混亂。在進行換液或傳代操作時,注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口,以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。所有細胞一旦購置,或從別處引入,或自己建立,均應及早留種凍存,一旦發生污染可棄之復蘇,重新培養。

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