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    載體的一些基礎知識以及如何閱讀質粒圖譜
    2015-8-18
    來源:互聯網
    點擊數: 8996          作者:未知
    • 載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質粒dna是一種新的非病毒轉基因載體。這里主要介紹下一個合格質粒的組成要素、載體的一些基本知識以及如何閱讀質粒圖譜。

      一、一個合格質粒的組成要素

      復制起始位點Ori 即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。

      抗生素抗性基因 可以便于加以檢測,如Amp+ ,Kan+

      多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因片段

      P/E 啟動子/增強子

      Terms 終止信號

      加poly(A)信號 可以起到穩定mRNA作用

      二、如何閱讀質粒圖譜

      第一步:首先看Ori的位置,了解質粒的類型(原核/真核/穿梭質粒)

      第二步:再看篩選標記,如抗性,決定使用什么篩選標記。

      1、Ampr 水解β-內酰胺環,解除氨芐的毒性。

      2、tetr 可以阻止四環素進入細胞。

      3、camr 生成氯霉素羥乙?;苌?,使之失去毒性。

      4、neor(kanr)氨基糖苷磷酸轉移酶 使G418(長那霉素衍生物)失活

      5、hygr 使潮霉素β失活。

      第三步:看多克隆位點(MCS)。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入,會導致某種標志基因的失活,而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

      第四步:再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說,外源DNA片段越長,越難插入,越不穩定,轉化效率越低。

      第五步:是否含有表達系統元件,即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體??寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體,還是要以實驗目的為準繩。

      啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號

      啟動子-促進DNA轉錄的DNA順序,這個DNA區域常在基因或操縱子編碼順序的上游,是DNA分子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位,但啟動子本身不被轉錄。

      增強子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子-負增強子,負調控序列。

      核糖體結合位點/起始密碼/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖體的兩個結合位點,對于原核而言是AUG(起始密碼)和SD序列。

      轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子:結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列,此位點down-stream有一段GT或T富豐區,這2部分共同構成poly(A)加尾信號。結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列,此位點down-stream有一段GT或T富豐區,這2部分共同構成poly(A)加尾信號。

      回答有人之前提出的一個問題:為什么質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針,那其實是代表兩條DNA鏈,即質粒是環狀雙鏈DNA,它的啟動子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上.

      三、介紹一下關于載體的知識

      1、什么是載體

      即要把一個有用的基因(目的基因——研究或應用基因)通過基因工程手段送到生物細胞(受體細胞),需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進入受體細胞,這種運載工具就叫做載體(vector)。

      P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子,是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA

      2、載體的分類

      按功能分成:

      (1)克隆載體 都有一個松弛的復制子,能帶動外源基因,在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段(基因)的載體。(所以有時實驗時擴增效率低下,要注意是不是使用的嚴謹行載體)

      (2)表達載體 具有克隆載體的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。

      按進入受體細胞類型分:

      (1)原核載體

      (2)真核載體

      (3)穿梭載體(sbuttle vector)指在兩種宿主生物體內復制的載體分子,因而可以運載目的基因(穿梭往返兩種生物之間)。

      穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子,以確保兩類細胞中都能擴增。

      3、基因工程載體的3個特點:

      (1)都能獨立自主的復制:載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被動的跟著載體一起復制/擴增,就像載體的正常成分一樣。

      (2)都能便利的加以檢測: 如載體的藥物抗性基因,多是抗生素抗性基因,將受體細胞放在含有該抗生素培養板上培養生長時,只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。

      (3)都能容易進入宿主細胞中去,也易從宿主細胞中分離純化出來。

      4、載體的選擇和制備:

      選擇載體主要依據構建的目的,同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因,則要選擇合適的表達載體。

      載體選擇主要考慮下述3點:

      (1)構建DNA重組體的目的,克隆擴增/表達表達,選擇合適的克隆載體/表達載體。

      (2)載體的類型:

         1)克隆載體的克隆能力-據克隆片段大小(大選大,小選小)。如<10kb選質粒。

         2)表達載體據受體細胞類型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳類細胞表達載體。

         3)對原核表達載體應該注意3點:

             ① 選擇合適的啟動子及相應的受體菌;

             ② 用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位;

             ③ 表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。

      (3)載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異,適應目的基因與載體易于鏈接,不產生閱讀框架錯位。

      選用質粒(最常用)做載體的4點要求:

        1)選分子量小的質粒,即小載體(1-1.5kb)→不易損壞,在細菌里面拷貝數也多(也有大載體);

        2)一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束,一般10個以上的拷貝,而嚴謹型質粒<10個。

        3)必需具備一個以上的酶切位點,有選擇的余地;

        4)必需有易檢測的標記,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(試一試)。

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