• <bdo id="iqq2a"><code id="iqq2a"></code></bdo>
    <bdo id="iqq2a"></bdo>
  • <blockquote id="iqq2a"></blockquote>
    <sup id="iqq2a"><input id="iqq2a"></input></sup>
  • <small id="iqq2a"><blockquote id="iqq2a"></blockquote></small>
    • 1
    • 2
    • 3
    聯系我們
    • 地址:杭州余杭經濟技術開發區興國路519號生物醫學谷5號樓二樓
      郵編:311188
      電話:0571-89028163
      手機:13003659111/13093769111
      商務QQ:1269136227
      聯系人:吳女士

    真核細胞表達系統的類型與常用真核細胞表達載體
    2015-8-18
    來源:互聯網
    點擊數: 7827          作者:未知
    • 原核表達系統是常被用來研究基因功能的成熟系統,由于原核表達系統具有包涵體蛋白不易純化、蛋白修飾不完整等缺陷,人們也開始利用真核細胞表達系統來研究基因。

      自上世紀70年代基因工程技術誕生以來,基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行,在技術方法上得到了很大發展,時至今日已取得令人矚目的成就。隨著人類基因組計劃的完成,越來越多的基因被發現,其中多數基因功能不明。利用表達系統在哺乳動物細胞內表達目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

      在各種表達系統中,最早被采用進行研究的是原核表達系統,這也是目前掌握最為成熟的表達系統。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌),通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物,而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點:如通常使用的表達系統無法對表達時間及表達水平進行調控,有些基因的持續表達可能會對宿主細胞產生毒害作用,過量表達可能導致非生理反應,目的蛋白常以包涵體形式表達,導致產物純化困難;而且原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善,表達產物的生物活性較低。

      為克服上述不足,許多學者將原核基因調控系統引入真核基因調控領域,其優點是:

      ① 根據原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設計,而靶DNA與真核基因調控序列基本無同源性,故不存在基因的非特異性激活或抑制;

      ② 能誘導基因高效表達,可達105倍,為其他系統所不及;

      ③ 能嚴格調控基因表達,即不僅可控制基因表達的“開關”,還可人為地調控基因表達量。

      因此,利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視。目前,基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。

      1、酵母表達系統

      最早應用于基因工程的酵母是釀酒酵母,后來人們又相繼開發了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表達系統是目前應用最廣泛的酵母表達系統。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3種。以Pichia Pastoris應用最多。

      甲醇酵母的表達載體為整合型質粒,載體中含有與酵母染色體中同源的序列,因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1),在該基因的啟動子(PAXOI)作用下,外源基因得以表達。PAXOI是一個強啟動子,在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOx1基因的表達受到抑制,而在以甲醇為唯一碳源時PAXOI可被誘導激活,因而外源基因可在其控制下表達,將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達水平及產量。此外甲醇酵母的表達載體都為E.coli/Pichia Pastoris的穿梭載體,其中含有E.coli復制起點和篩選標志,可在獲得克隆后采用E.coli細胞大量擴增.目前,將質粒載體轉入酵母菌的方法主要有原生質體轉化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養基中生長。培養至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞,不會發生超糖基化。

      利用PAXOI表達外源蛋白時,一般需很長時間才能達到峰值水平,而甲醇是高毒性、高危險性化工產品。使得實驗操作過程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產。因此那些不需要甲醇誘導的啟動子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子代替PAXOI,不需要甲醇誘導。培養過程中無需更換碳源,操作更為簡便,可縮短外源蛋白到達峰值水平的時間。

      酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統,由于兼具原核以及真核表達系統的優點,正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用。

      2、昆蟲細胞表達系統

      桿狀病毒表達系統是目前應用最廣的昆蟲細胞表達系統,該系統通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(AcNPV)作為表達載體。在AcNPV感染昆蟲細胞的后期,核多角體基因可編碼產生多角體蛋白,該蛋白包裹病毒顆??尚纬砂w。核多角體基因啟動子具有極強的啟動蛋白表達能力,故常被用來構建桿狀病毒傳遞質粒??寺∪胪庠椿虻膫鬟f質粒與野生型 AcNPV共轉染昆蟲細胞后可發生同源重組,重組后多角體基因被破壞,因而在感染細胞中不能形成包涵體,利用這一特點可挑選 出含重組桿狀病毒的昆蟲細胞但效率比較低,且載體構建時間長,一般需要4~6周。此外,昆蟲細胞不能表達帶有完整N聯聚糖的真核糖蛋白。

      在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表達引起昆蟲細胞的裂解,胞質內的物質釋放出來,與 目的蛋白混在一起,從而使蛋白的純化工作變得很困難,另外水解酶的釋放會降解重組蛋白。為了克服以上這些困難,科學工作者先后嘗試用絲蛾肌動蛋白基因啟動子或桿狀病毒ie-1基因啟動子表達外源蛋白,但效果都不明顯。Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細胞表達系統,該系統主要包括3個調節外源蛋白表達序列:

      (1)Bombyx mori的肌動蛋白基因啟動子;

      (2)Bombyx mori的核型多角體病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(編碼俄IE-1蛋白,該蛋白是種轉錄激活因子,可在體外激活肌動蛋白基因啟動子);

      (3) BmNPV的同源重復序列3(HR3)可作為肌動蛋白基因啟動子的增強子。三者協同作用,可使轉錄活性提高 1000倍以上,從而大大地提高外源蛋白的表達水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應用于昆蟲細胞表達系統的構建,該病毒由AcNPV及 Bni'qP發展而來。

      一般情況下桿狀病毒表達系統所能表達的外源蛋白只有少部分是分泌性的,大部分為非分泌性。為了解決這個問題將Hsp70(熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達可明顯提高重組蛋白的分泌水平,這是因為分泌性多肽被翻譯后必須到達內質網進行加工才能被分泌至胞外。如果到達內質網前,前體多肽就伸展開來,暴露出疏水殘基,殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚,這對最終的表達水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶,能夠與新翻譯的多肽結合,抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達內質網進行加工,從而提高蛋白的分泌水平。

      最近,人們又構建了桿狀病毒-S2表達系統,該系統能將重組桿狀病毒轉染果蠅S2細胞,以前人們認為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細胞(如 sf9、sf21)中復制,不能在其他昆蟲細胞(如果蠅細胞)中復制,然而目前研究表明在一定條件下,桿狀病毒也能感染果蠅細胞。在果蠅細胞中,桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發生作用。桿狀病毒-S2表達系統的表達載體利用的是果蠅啟動子如Hsp70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等,其中,Hsp70啟動子的作用最強。重組桿狀病毒感染S2細胞后不會引起宿主細胞的裂解,且蛋白表達水平與鱗翅目細胞相似,因此,桿狀病毒-S2系統是一個很有應用前景的昆蟲細胞表達系統。昆蟲細胞表達系統,特別是桿狀病毒表達系統由于其操作安全,表達量高,目前與酵母表達系統一樣被廣泛應用于基因工程的各個領域中。

      3、哺乳動物細胞表達系統

      由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質,在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統,更接近于天然蛋白質。哺乳動物細胞表達載體包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。

      將外源基因導入哺乳動物細胞主要通過2類方法 :一是感染性病毒顆粒感染宿主細胞,二是通過脂質體法、顯微注射法 、磷酸鈣共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因導入到細胞中。外源基因的體外表達一般采用質粒表達載體,如將重組質粒導入CHO細胞可建立高效穩定的表達系統,而利用COS細胞可建立瞬時表達系統。目前,病毒載體已成為動物體內表達外源基因的有力工具,在臨床基因治療的探索中也發揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當大(約187kb),利用它作為載體可同時插入幾種外源基因,從 而構 建多價疫苗。另外,逆轉錄病毒感染效率高,某些難轉染的細胞系也可通過其導入外源基因,但要注意的是逆轉錄病毒可整合入宿主細胞染色體,具有潛在的危險性。

      由于腺病毒易于培養、純化,宿主范圍廣,故采用該類病毒構建的載體被廣泛應用腺病毒載體的構建依賴于腺病毒穿梭質粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細胞內的這種同源重組效率很低,利用細菌內同源重組法構建重組體效率會大大提高,即將外源基因插入到腺病毒穿梭質粒中,形成轉移質粒,將其線性化后與腺病毒包裝質粒共轉化大腸埃希菌。另一種方法是通過CrelaxP系統構建重組腺病毒載體,在轉移質粒和包裝質粒中都插入laxP位點,然后將兩個質粒共轉染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞,通過Cre介導兩個laxP位點之間的DNA發生重組,可獲得重組腺病毒,這種重組效率比一般的細胞內同源效率高30倍。最近,人們在桿狀病毒中插入巨細胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒,在哺乳動物細胞中不會引起病毒基因的表達,而且載體的構建容易,因而利用桿狀病毒進行基因轉移為我們提供了很好的途徑。

      利用哺乳動物細胞表達外源基因時,大多數情況下不需要誘導,但當表達產物對細胞有毒性時應采取誘導,這樣可避免表達產物產生早期就對細胞產生影響。哺乳動物細胞中用到的誘導型載體主要與啟動子有關如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導,還有重金屬、糖皮質激素誘導的啟動子。但這些系統存在一些共同的缺陷,如誘導表達特異性差;當系統處于關閉狀態時表達有泄漏誘導劑本身有毒性,常對細胞造成損傷等。

      為此,Gossen等構建了受四環素負調節的Tet-on基因表達系統,該系統由調節質粒和反應質粒組成。調節質粒中具有編碼轉錄激活因子(fIA)的序列,在沒有四環素或強力毒素存在的情況下 tTA可引起下游目的基因表達。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進行了改造,構建了受四環素正調節的Tet-on基因表達系統,該系統在沒有四環素的情況下啟動子不被激活,而在加入四環素或強力毒素后目的基因高效表達。四環素誘導的基因表達系統是目前應用最廣泛的哺乳動物細胞誘導表達系統,該系統具有嚴密、高效可控制性強的優點。

      外源蛋白的表達會對哺乳動物細胞產生不利影響,因此利用哺乳動物細胞表達外源基因時,一個主要問題便是外源基因不能持久穩定地表達。Mielke等構建了一種能夠在哺乳動物中穩定表達異二聚體蛋白的載體系統,在這個系統中,編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉錄成三順反子mRNA。內部的順反子通過內核糖體進入位點(IREs)介導進行翻譯,通過持續選擇壓力,無需繁瑣的篩選過程,便可獲得持久、穩定表達抗體分子的重組體。

      哺乳動物細胞表達系統常用的宿主細胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等,不同的宿主細胞對蛋白表達水平和蛋白質的糖基化有不同的影響,因此在選擇宿主細胞時應根據具體情況而定。

      利用基因工程技術表達外源蛋白。其產量還不高,難以滿足大規模的實際應用。通過轉基因動物或轉基因植物技術可從動物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質,但目前這項技術還不很成熟,有待進一步研究。

      4、結語

      目前已經建立了多種誘導表達系統,但它們都有其優點和不足,這就需要我們根據自己的要求選用適當的表達系統。一般來說,一個理想的可誘導表達系統需要符合下述幾個方面的要求:

      特異性:該系統不受其他內源因素的影響,僅能被外源的非毒性藥物所活化。

      非干擾性:該系統成分不能對細胞通路有干擾。

      可誘導性:該系統在非活化狀態下本底活性最低,而在活化狀態下能快速產生高水平的基因表達。

      誘導劑的生物利用率:調節分子能快速滲透人各組織,能通過胎盤屏障及血腦屏障。

      可逆性:誘導劑能快速被各組織清除使該系統很快恢復非活化狀態。

      劑量依賴性:該系統的反應與誘導劑的濃度成正比,以便進行定性定量分析。

      總之,各種表達系統各有其優缺點,酵母和昆蟲細胞表達系統蛋白表達水平高,生產成本低,但它們的加工修飾體系與哺乳動物細胞不完全相同;哺乳動物細胞產生的蛋白質更接近于天然蛋白質,但其表達量低、操作繁瑣。各種表達系統由于翻譯后的加工不完全相同,因而產生的重組蛋白的生物學活性和免疫原性有時會有差別。Van der GeId等利用不同的表達系統表達了蛋白激酶(PR30),并對它們的抗原性進行了比較,結果發現,在哺乳動物細胞中表達的PR3具有與抗PR3抗體結合的所有表位,在昆蟲細胞中表達的PR3具有大部分表位,而在 甲醇酵母中表達的PR3只具有少數幾個表位。因此,選擇表達系統時,必須充分考慮各種因素,如所需表達的蛋白質性質、實驗條件、生產成本、表達水平、安全性等,權衡利弊后再選擇相應的表達系統。

      真核細胞常見表達載體

      (1)pCMVp-NEO-BAN載體

      特點: 該真核細胞表達載體分子量為6600堿基對,主要由CMVp啟動子、兔β-球蛋白基因內含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架構成, 在大多數真核細胞內都能高水平穩定地表達外源目的基因。更重要的是,由于該真核細胞表達載體中抗neo基因存在,轉染細胞后,用G418篩選,可建立穩定的、高表達目的基因的細胞株。

      插入外源基因的克隆位點包括Sal1、BamH1和EcoR1位點。注意在此載體中有二個EcoR1位點存在。

      (2)pEGFP, 增強型絳色熒光蛋白表達載體(Enhanced Fluorecent Protein Vector)

      特點:   pEGFP表達載體中含有綠色熒光蛋白,在PCMV啟動子驅動下,在真核細胞中高水平表達。載體骨架中的SV40 origin使該載體在任何表達SV40 T 抗原的真核細胞內進行復制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成,能應用G418篩選穩定轉染的真核細胞株。此外, 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復制, 而位于此表達盒上游的細菌啟動子能驅動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達。

      用途:該表達載體EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位點,將外源基因扦入這些位點,將合成外源基因和EGFP的融合基因。 借此可確定外源基因在細胞內的表達和/或組織中的定位。

      亦可用于檢測克隆的啟動子活性(取代CMV啟動子,Acet1-Nhe1)。

      3、pEGFT-Actin, 增強型綠色熒光蛋白/人肌動蛋白表達載體

      特點:pEGFP-Actin表達載體中含有綠色熒光蛋白和人胞漿β-肌動蛋白基因,在PCMV啟動子驅動下,在真核細胞中高水平表達。載體骨架中的SV40 origin使該載體在任何表達SV40 T 抗原的真核細胞內進行復制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成,能應用G418篩選穩定轉染的真核細胞株。此外, 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復制, 而位于此表達盒上游的細菌啟動子能驅動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達。

      用途:pEGFP-Actin載體在真核細胞表達EGFP-Actin融合蛋白,該蛋白能整合到胞內正在生的肌動蛋白,因而在活細胞和固定細胞中觀察到細胞內含肌動蛋白的亞細胞結構。

      4、pSV2表達載體

      特點:該表達質粒是以病責SV40啟動子驅動在真核細胞目的基因進行表達的,克隆位點為Hind111。SV40啟動子具有組織/細胞的選擇特異性。此載體不含neo基因,故不能用來篩選、建立穩定的表達細胞株。

      5、CMV4 表達載體

      特點:該真核細胞表達載體由CMV啟動子驅動,多克隆區域酶切位點選擇性較多。含有氨芐青霉素抗性基因和生長基因片段以及SV40復制原點和fl單鏈復制原點。但值得注意的是,該表達載體不含有neo基因,轉染細胞后不能用G418篩選穩定的表達細胞株。

      其他常用克隆Vector:

      pBluscript II KS DNA 15 ug

      pUC18 DNA 25 ug

      pUC19 DNA 25 ug

      說明:

      pBluescript II kS、pUC18 & Puc19載體適合于DNA片段的克隆、DNA測序和對外源基因進行表達等。這些載體由于在lacZ基因中含有多克隆位點,當外源DNA片段扦入,轉化lacZ基因缺乏細胞,并在含有IPTG和X-gal的培養基上培養時,含有外源DNA載體的細胞將為白色菌落,而無外源DNA片段載體的細胞則為蘭色菌落,由此易于篩選有無外源DNA片段的載體。此外,這些載體中有便于測序的M13、T7和T3的通用引物進行DNA測序。

      保存液:TE Buffer

      TE Buffer組成:

      10mM Tris.HCL(Ph 8.0)

      1mM EDTA

      用途:

      克隆外源DNA片斷.

      進行基因表達.

      使用M13、T7和T3引物進行測序.

      存在的問題

      細胞的生命活動是一個復雜的調控過程,有些生命活動的機理還不完全清晰,由于插人的目的基因不同,載體構建栗用的順式組件不同,組裝的空間位置不同,采用的表達系統不同,目的基因表達水平和陽性克隆篩選率都會有很大差異。另外,由于所有的順式元件存在種屬和組織特異性,所構建的高效表達載體不一定在所有細胞株中均高效表達。再者,細胞生長狀態的差異,轉染方法的不同培養時閹的長短,篩選藥物濃度的高低,對表達量都有很大影響。所以,需要綜合評價一個表達載體和表達系統,排除一些不定因素,篩選出最佳組合

      真核表達載體趨向于既有利于擴增目的基因又有利于篩選陽性克隆的載體的構建。許多有效的應用范圍廣的強啟動子和增強子被人發現并應用于載體中,大大提高了目的基因的表達量,另外一些強的組成型啟動子,如 SV40早期啟動子+PHTLv,已應用于大規模生產的細胞系中。

      應用以GS為篩選標志的表達載體可兼有篩選和擴增目的基因兩種功能,是目前研究的重點。以IRES連接的雙順反子表達載體已成為核表達載體的主體。在同一啟動子操縱下,篩選基因或報告基因與目的基因轉錄在同一mRNA上通過 IRES的作用,表達出兩種蛋白,因而在理論上可認為,通過了篩選或表達了報告基因的克隆必為陽性克隆,即表達目的基因的克隆,有報道說這種雙順反子的共表達率為90%。這就大大提高了篩選率,簡化了實驗過程。

      將強啟動子、增強子和可擴增的篩選標志組裝在同一載體上,構建高效表達和篩選的表達載體并將其運用于最合適的表達系統中,是當今真核表達載體構建研究發展方向。

      真核細胞表達系統主要包括酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。真核細胞常見表達載體為:pCMVp-NEO-BAN載體、pEGFP,增強型絳色熒光蛋白表達載體、pEGFT-Actin 增強型綠色熒光蛋白/人肌動蛋白表達載體、pSV2表達載體、CMV4 表達載體。

    關于我們聯系方式客戶留言投訴建議

    免責聲明:部分技術資料來源于網絡,若有侵權,敬請告知刪除

    版權所有 Copyright(C)2015-2020 杭州博茵生技術有限公司 浙ICP備15030673號-1

  • <bdo id="iqq2a"><code id="iqq2a"></code></bdo>
    <bdo id="iqq2a"></bdo>
  • <blockquote id="iqq2a"></blockquote>
    <sup id="iqq2a"><input id="iqq2a"></input></sup>
  • <small id="iqq2a"><blockquote id="iqq2a"></blockquote></small>
    色yeye香蕉凹凸视频在线观看_俄罗斯肥妇大屁股撒尿_国产天堂久久天堂av色综合_俄罗斯女人和动zozozo